DB37∕T 4754.1-2024 动物疫病鉴别检测技术 第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒(山东省)
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0.37 |
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11 |
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日期： |
2024/9/20 |
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ICS,11.220,CCS,B 41 37,山东省地方标准,DB37/T 4754.1—2024,动物疫病鉴别检测技术 第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒,Animal disease identification and detection technology—Part 1: Classical swine fever virulent strain and vaccine strain,2024 - 09 - 03发布,2024 - 10 - 03实施,山东省市场监督管理局 发布,DB37/T 4754.1—2024,I,前言,本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草,本文件是DB37/T 4754《动物疫病鉴别检测技术》的第1部分。DB37/T 4754已经发布了以下部分：,——,第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒,请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任,本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施,本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口,DB37/T 4754.1—2024,II,引言,动物疫病是影响山东省畜牧业健康发展的重要因素之一。不同病原或者相同病原的不同血清型/基因型引起疫病的临床病症具有一定程度的相似性，一些疫病弱毒疫苗的使用也干扰了病原的检测。动物疫病鉴别检测技术标准的建立，规定了对不同病原、相同病原的不同血清型/基因型以及弱毒疫苗株的鉴别检测，为山东省动物疫病精准防控提供了技术支持，对于促进畜牧业健康发展具有重要意义,猪瘟病毒（Classical swine fever，CSFV）属于黄病毒科瘟病毒属成员，是引起猪瘟的病原体。猪瘟严重危害养猪业，世界动物卫生组织将其列为必须通报的动物疫病之一，我国将其列为二类动物传染病。猪是猪瘟病毒的唯一宿主。在自然条件下，病毒经口腔和鼻腔途径进入宿主，也可通过损伤的皮肤或伤口感染，感染的猪在潜伏期便可排出病毒，病毒随病猪的分泌物和排泄物污染的饲料和饮水进入机体。我国从20世纪50年代便开始广泛应用兔化弱毒疫苗做预防注射，在控制猪瘟中起到重要的作用，随着养猪业的不断发展，集约化养猪场规模越来越大，国内生猪的交易和流通日趋频繁，给猪瘟的防制带来了挑战。各地猪瘟仍时有发生，而且多表现为非典型、慢性及隐性状态，并出现猪瘟病毒的持续感染和妊娠母猪带毒综合征。这给兽医临床诊断带来了很大困难。中国猪瘟弱毒疫苗的全面应用，使生猪携带猪瘟疫苗毒成为常态，导致常规的猪瘟病毒核酸检测难以区分猪瘟病毒的强毒感染和免疫接种的疫苗弱毒，迫切需要建立一种快速、特异的标准技术来区分猪瘟强毒和猪瘟疫苗弱毒，为保障我省养猪业的健康发展发挥引领和示范作用。本标准制定后，作为《动物疫病鉴别检测技术》的1部分，《动物疫病鉴别检测技术》拟由以下部分构成,——,第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒。目的在于规范猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒SYBR Green I荧光RT-PCR鉴别检测技术的操作，便于检测技术在猪瘟临床诊断、流行病学调查、检验检疫、猪瘟疫苗质量控制等方面的稳定应用,——,第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2型。目的在于规范兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2型实时荧光RT-PCR鉴别检测技术的操作，便于检测技术在兔瘟临床诊断、流行病学调查、检验检疫等方面的稳定应用,——,第3部分：禽腺病毒Ⅰ群与禽腺病毒Ⅲ群。目的在于规范禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群PCR鉴别检测技术的操作，便于检测技术在禽腺病毒病临床诊断、流行病学调查、检验检疫等方面的稳定应用,DB37/T 4754.1—2024,1,动物疫病鉴别检测技术 第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒,1 范围,本文件规定了猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒SYBR Green I荧光RT-PCR鉴别检测,本文件适用于猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒的鉴别检测,2 规范性引用文件,下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件,GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法,GB 19489 实验室 生物安全通用要求,NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范,3 术语和定义,本文件没有需要界定的术语和定义,4 试验原理,本文件通过特异性引物，在RT-PCR反应体系中扩增出了猪瘟疫苗弱毒126 bp及猪瘟强毒335 bp的目的产物，当SYBR Green I荧光染料与扩增产物结合时，荧光信号增强，从扩增产物上释放出来时，荧光信号急剧减弱，不同DNA扩增产物，Tm值不同，通过Tm值的差异及荧光信号的变化实现了猪瘟疫苗弱毒与猪瘟强毒扩增产物的鉴别,注：,SYBR Green I是一种只与双链DNA小沟结合的染料,5 试剂和材料,除非另有说明，仅使用分析纯试剂,水：GB/T 6682，一级,焦碳酸二乙酯 （DEPC）水,取1 mL DEPC加入水至1 000 mL，充分震荡混匀，静置24 h后，121 ℃高压灭菌15 min，2 ℃～8 ℃保存备用,磷酸盐缓冲溶液（PBS）,取Na2HPO4.12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，NaCl 8 g，溶于800 mL水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH调节至7.4，加水定容至1 000 mL，121 ℃高压灭菌15 min，2 ℃～8 ℃保存备用,氢氧化钠溶液（3%）,称取3 g氢氧化钠，溶于少量水中，放置室温后，加水定容至100 ……
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